背景介绍
蛋白免疫印迹( Western Blot)是将PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
一． 仪器与材料
1. 仪器
1) 电泳仪 2)电转仪 3)摇床 4)化学发光成像仪
2. 材料
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1) 30%丙烯酰胺溶液 |
2) 1.5 mol/L Tris (pH8.8) |
3) 1.0 mol/L Tris (pH6.8) |
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4) 10%SDS |
5) 10%过硫酸胺 |
6) TEMED |
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7) 5× 上样缓冲液 |
8) 5× SDS电泳缓冲液 |
9) 10×转移缓冲液 |
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10) NC膜 |
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11) 洗涤液：TBST（1×TBS，0.1%TWEEN20）
12) 封闭液，抗体稀释液：5%脱脂奶粉的TBST
13) HRP-羊抗兔IgG
14) ECL底物液A
15) ECL底物液B
二． 操作步骤
1. 组装制胶平台
玻璃板用自来水清洗干净，晾干。去离子水检漏后，用滤纸吸去玻璃板中残留的水。
2. 配制所需浓度分离胶（配方见附表）
注意：如果发现10%SDS有沉淀，可先放置50℃左右的温箱或温水浴中至沉淀溶解，待其冷却后方能配胶； 胶液配好后要充分混匀。
3. 灌分离胶
灌胶时要防止气泡产生，每次不要把枪头中液体完全打尽，以免带进气泡，一块0.75mm厚度的胶需加入约4ml的分离胶，灌完后在胶面上轻轻加入2ml蒸馏水封胶。室温凝胶30-40分钟。胶凝后将封胶水倒掉，并用滤纸吸干微量剩余的水。
4. 配制 5% 浓缩胶（配方见附表）
5. 灌浓缩胶
将浓缩胶加满至整个制胶平板，插上合适的梳子。室温凝胶30分钟后。将玻璃板取出，并将玻璃板反转置于内侧。在电泳缓冲液中将梳子拔出。
6. 样品准备
同时进行样品处理 (样品与5×上样缓冲液按照体积比2: 1混合)，100℃煮沸5分钟。将处理好的样品放置4℃冰箱预冷5分钟。如有沉淀，则将样品离心弃沉淀。
7. 上样
在电泳芯内层玻板之间灌满电泳缓冲液；依次点上样品及Marker。
8. 电泳：90V恒压跑浓缩胶，然后120 V恒压跑分离胶
9. 转膜准备
剪好大小与胶相同的1张NC膜和4层滤纸，将膜取出（要用镊子，不可以用手直接接触膜表面）先在水中浸泡10分钟，以除去气泡；然后置于1×转移缓冲液中平衡20分钟。再将滤纸于1×转移缓冲液中浸透平衡，时间不宜过长。按照滤纸-凝胶-膜-滤纸三明治式放好。胶和膜之间不能有气泡。膜在正极，胶在负极。
10. 转膜
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检测蛋白分子量 |
转膜条件 |
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＞200kd |
200mA过夜，（70V） |
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100-200kd |
150 mA过夜，（60V）或200mA，1.5h~2h |
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30-100kd |
200mA，1h-1.5h，（70V）或100mA过夜（35V） |
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＜30kd |
200mA，45min-1h（70V） |
将预冷的转移缓冲液加入到转印槽中，按所需条件调好仪器参数，在放置了冰块的水中进行转膜。
11. 收膜和封闭
转膜终止，取出NC膜并用TBST清洗，做好标记后可根据需要置于立春红染液中观察转膜效果，观察完用TBST清洗，然后放入加有封闭液的容器中，室温封闭1 hr左右。封闭后用TBST清洗，或晾干备用保存至-20℃冰箱。
12. 切膜
将转好的膜用TBST先浸泡透，取出后将转有蛋白的一面朝上放置在平板上，用刀按方案所需将膜裁切，并在无蛋白位置作好标记（包括抗体编号，膜编号等），分别放入到各反应槽中。
(磷酸酶实验CIP)
用水稀释10x 磷酸酶buffer至1x工作液，以每个泳道50单位CIP配5ml工作液的体系孵膜，37℃孵
育2小时。将孵完CIP的膜在TBST中洗净。
13. 孵育一抗
将各个反应槽中加入所需反应体积的5%脱脂奶粉TBST，然后按照设计方案的稀释度分别加入相应体积的一抗样品。4℃缓慢摇晃过夜。
14. 洗涤
在各个反应槽中加入适量的TBST，摇床摇动5分钟，然后将TBST倒掉，重复3次。
15. 孵育二抗
配制二抗孵育液：将HRP-羊抗兔IgG二抗按照工作稀释比例加到5%脱脂奶粉TBST中，摇床混匀5分钟。将洗涤过的NC膜全部取出，转移到二抗孵育液中室温1小时。
16. 洗涤
倒掉二抗孵育液，加入适量TBST，摇床摇动5分钟，然后将TBST倒掉，重复3次。
17. 底物反应
配制ECL反应底物：临用前，将ECL底物液A 和ECL底物液B等体积混合并混匀，避光保存备用。
将配好的反应底物液均匀的滴加在膜上，保证所有膜都被反应液完全覆盖后，反应1-2分钟，注意膜的位置不要有气泡。
18. 曝光
预先打开凝胶成像仪，调节至最佳条件，将放有膜的平板放入暗箱内，开始曝光。根据情况选择最适的曝光时间。
19. 结果保存
选择最佳图片，整理归档。
