操作步骤
(推荐#CK0062 免疫组化试剂盒)，CK0063免疫组化笔
1、组织固定：在脱蜡之前，将切片 60°C 恒温箱中烘烤 60 分钟。
2、脱蜡：将切片用二甲苯浸泡 10 分钟，更换二甲苯后再浸泡 10 分钟。
3、水化：分别用无水乙醇浸泡 5 分钟；95%乙醇中浸泡 5 分钟；85%乙醇中浸泡5 分钟；75%乙醇中浸泡5分钟。
4、洗涤：ddH2O 浸泡 5 分钟，清洗 3 次。
5、抗原修复（煮沸法）：压力锅中加入足以淹没切片的 10 mmol/L 的枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）（配制：将复性剂溶于相应体积 ddH2O 中，混匀），加热至沸腾，切片置耐热塑料切片架上，放入锅中，盖好锅盖，扣上压力阀，继续加热，设置保压 3 分钟，时间到后打开放气阀放气，压力归零后开锅盖将内锅取出放置室温冷却，待溶液冷却至室温后取出切片（约 30 分钟）。
6、洗涤：ddH2O 浸泡 5 分钟，清洗 2 次，PBST 浸泡 5 分钟，清洗 2 次。 www.sabbiotech.com 成份 20 片 50 片复性剂（溶解前请混匀） 6 g （溶于 2 L ddH2O） 15 g（溶于 5 L ddH2O）HRP 标记的二抗（抗兔/小鼠） 500 μl 1.25 ml DAB 缓冲液（20X） 50 μl 125 μl DAB 底物（20X） 50 μl 125 μl DAB 色原（20X） 50 μl 125 μl 苏木素体细胞快速染色液 1 ml 2.5 ml For Research Use Only Order:order@signalwayantibody.com Support:tech@signalwayantibody.com
7、灭活酶：每张切片滴加 50 μl 灭活酶试剂，室温避光处理 15 分钟。
8、洗涤：PBST 浸泡 5 分钟，清洗 3 次。（第一次迅速倒掉）
9、封闭：每张切片滴加 3% BSA-PBST 50 μl，湿盒中室温封闭 30 分钟。
10、加一抗：弃去封闭液，每张切片滴加 50 μl 一抗，4°C 湿盒中孵育过夜或 37°C 1 小时。
11、复温：次日取出切片，室温复温 40 分钟。（复温仅针对一抗 4°C 孵育过夜，37℃孵育直接进行下一步）
12、洗涤：PBST 浸泡 5 分钟，清洗 3 次。（第一次迅速倒掉）
13、加酶标二抗：每张切片滴加 HRP 标记的二抗（抗兔/小鼠）25 μl，室温或37°C 孵育30 分钟。
14、洗涤：PBST 浸泡 5 分钟，清洗 3 次。（第一次迅速倒掉）
15、显色（DAB 法）：每张切片滴加 50 μl 显色液（显色液配制：85% ddH2O+ 5% DAB 缓冲液+5%DAB底物+5%DAB色原，避 光现配现用，按需要量配制），湿盒中显色 5 分钟。
16、终止显色：用蒸馏水终止显色反应。
17、复染：每张切片滴加 50 μl 苏木素体细胞快速染色液，染色 5 分钟，用蒸馏水冲洗干净。
18、脱色反蓝：将切片放入 1%盐酸~乙醇中脱色 3~5 秒后迅速取出放入蒸馏水中终止，再放入PBST 中反蓝5分钟。
19、封片：分别在 75%乙醇中浸泡 5 分钟；85%乙醇中浸泡 5 分钟；95%乙醇中浸泡5 分钟；无水乙醇中浸泡5分钟。用二甲苯浸泡 10 分钟，更换二甲苯后再浸泡 10 分钟。之后在切片上加中性树胶，加盖玻片。
20、观察：显微镜。
注意事项
抗原修复后需冷却，避免洗涤时脱片。
加抗体时避免交叉污染，导致假阳性。
显色时间可根据实际染色效果来确定，不一定遵循规定的时间。
封片时不要产生气泡，以免影响观察。
显微镜观察时可在低倍镜下先找好视野，再换高倍镜拍照。
如应用于冰冻切片，请用 4°C 丙酮固定 10 分钟，然后从第 6 步开始操作。
De-Paraffinization and Antigen Retrieval
1. Incubate slide at 60°C for 60 min.
2. Bath the slides in antigen retrieval solution and heat it to boil with a microwave on medium power.
Once boiling, immediately transfer to a small power and keep faint boiling while heating for 2-3 min.
3. Cool them to room temperature and wash rocking in distilled water several times.
4. Immerse slides in 3% H2O2 (in fresh methanol) for 15 min at room temperature.
5. Wash with TBS (pH 7.6) three times, 5 min each time.
Staining with Primary Antibody
1. Dilute primary antibody with 3% BSA in TBS. Cover the tissue section on the slide with diluted primary
antibody (use 50 – 150μl for each slide).
2. Incubate at 37°Cfor 2 hours (The optimal incubation time, incubation temperature, and antibody dilution
should be determined by the individual laboratory).
3. Wash with TBS three times, 5 min each time.
Staining with Secondary Antibody
1. Incubate with 100-200μl Polymer Enhancer. Incubate 30 min at room temperature.
2. Wash with TBS for 3 times, 5 min each time.
3. Incubate with 100-200μl Polymerized HRP and incubate 30 min at 37°C.
4. Wash with TBS for 3 times, 5 min each time.
5. Add DAB solution and incubate 3-5 min(The reaction progress and the optimal time should be determine
according to microscope).
6. Wash with distilled water for 2 times, 5 min each time.
7. Counterstain sections in hematoxylin if required,wash with distilled water.Immerse slides in 0.1% HCl-
ethanol for 1-10 seconds, wash with distilled water. Doing a counterstain of sections in hematoxylin for
1-2 min and wash them with distilled water.
8. Dehydrate through 100% ethanol for 5 min, 90% ethanol for 5 min, 75% ethanol for 5 min, and coverslip
with mounting medium.
