产品名称膜蛋白提取试剂盒

使用方法：
使用注意事项：
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
A． 细胞蛋白提取
1. 取5-10×106个以上细胞①，在4℃，500g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 细胞样品中加入200μl冷的试剂 A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10-15分钟，中间每隔几分钟涡旋混匀或用移液器吹打混匀。
注：此步如果细胞裂解不充分，下步有大量细胞沉淀，请延长冰浴裂解时间至30分钟或更长，直至细胞充分裂解，中间每隔几分钟充分混匀。
4. 再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，13000×g条件下离心5分钟。
5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，37℃水浴5-10分钟，37℃下②1000g-2000g力离心5分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白约为20-50μl。
6. 收集上层部分留作备用分析③。
7. 用150-200μl冰冷的试剂B稀释下层膜蛋白部分，混匀后冰浴2min，37℃水浴5-10分钟，37℃下②1000g-2000g力离心5分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白约为20-50μl。
8. 按步骤7再次抽提膜蛋白(此步骤可以选做)。
9. 用50-200μl冷的试剂C稀释下层膜蛋白部分，即得膜蛋白。
10. 将上述蛋白提取物定量④后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验⑤。
注：
① 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。由于膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。
② 必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。无可控温的离心机时，用常温的离心机在室温离心即可，适当缩短离心时间至2-3分钟。
③ 进行下游实验时，可用试剂C分别稀释上层和下层，取一个上层样品同时进行实验分析。