1、组织固定：在脱蜡之前，将切片60°C 恒温箱中烘烤60 分钟。
2、脱蜡：将切片用二甲苯浸泡10 分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟。
3、水化：分别用无水乙醇浸泡5 分钟；95%乙醇中浸泡5 分钟；85%乙醇中浸泡5 分钟；75%乙醇中浸泡5 分
钟。
4、洗涤：ddH2O 浸泡5 分钟，清洗3 次。
5、抗原修复（煮沸法）：压力锅中加入足以淹没切片的10 mmol/L 的枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）（配制：将复性剂
溶于相应体积ddH2O 中，混匀），加热至沸腾，切片置耐热塑料切片架上，放入锅中，盖好锅盖，扣上压力阀，
继续加热，设置保压3 分钟，时间到后打开放气阀放气，压力归零后开锅盖将内锅取出放置室温冷却，待溶液冷
却至室温后取出切片（约30 分钟）。
6、洗涤：ddH2O 浸泡5 分钟，清洗2 次，PBST 浸泡5 分钟，清洗2 次。
7、灭活酶：每张切片滴加50 μl 灭活酶试剂，室温避光处理15 分钟。
8、洗涤：PBST 浸泡5 分钟，清洗3 次。（第一次迅速倒掉）
9、封闭：每张切片滴加3% BSA-PBST 50 μl，湿盒中室温封闭30 分钟。
10、加一抗：弃去封闭液，每张切片滴加50 μl 一抗，4°C 湿盒中孵育过夜或37°C 1 小时。
11、复温：次日取出切片，室温复温40 分钟。（复温仅针对一抗4°C 孵育过夜，37℃孵育直接进行下一步）
12、洗涤：PBST 浸泡5 分钟，清洗3 次。（第一次迅速倒掉）
13、加酶标二抗：每张切片滴加HRP 标记的二抗（抗兔/小鼠）25 μl，室温或37°C 孵育30 分钟。
14、洗涤：PBST 浸泡5 分钟，清洗3 次。（第一次迅速倒掉）
15、显色（DAB 法）：每张切片滴加50 μl 显色液（显色液配制：85% ddH2O+ 5% DAB 缓冲液+5% DAB 底物+5% DAB
色原，避光现配现用，按需要量配制），湿盒中显色5 分钟。
16、终止显色：用蒸馏水终止显色反应。
17、复染：每张切片滴加50 μl 苏木素体细胞快速染色液，染色5 分钟，用蒸馏水冲洗干净。
18、脱色反蓝：将切片放入1%盐酸~乙醇中脱色3~5 秒后迅速取出放入蒸馏水中终止，再放入PBST 中反蓝5 分
钟。
19、封片：分别在75%乙醇中浸泡5 分钟；85%乙醇中浸泡5 分钟；95%乙醇中浸泡5 分钟；无水乙醇中浸泡5
分钟。用二甲苯浸泡10 分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟。之后在切片上加中性树胶，加盖玻片。
20、观察：显微镜。
