使用方法：
使用注意事项：
1) M11 染色液为 DMSO 溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头
也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
2) 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使 DMSO 溶液集中于管底。
3) 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
4) 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类
型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
5) 染色后立即进行分析。
1.染色工作液配制：
根据样本数量，用染料稀释液将 BBcellProbeTM M11 荧光染料 100 倍稀释，再用相应的培养基或者 HBSS 缓冲
液 20-400 倍稀释（对于后续需要做固定或透化的样本，20-100 倍稀释），配制成染色工作液。
注：
1) 也可以直接用相应的培养基或 HBSS 等缓冲液稀释 M11 染料母液至所需浓度。
2) 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
3) 开始实验前，使用培养基或 HBSS 缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。工作浓度为根据不同细胞的预实
验结果确定的最佳工作浓度，一般染色终浓度 2000-40000 倍稀释。
4) 为了降低过度加载染料导致的潜在背景和线粒体毒性，在不影响实验结果的前提下应尽可能低浓度染色。
另外，浓度过高也可能造成非特异性染色，对其他细胞结构进行染色。
5) 工作液现配现用。
6) 为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。
2. 细胞染色
2.1 对于贴壁细胞
1) 培养皿/培养板准备细胞样本。
2) 待细胞生长到合适丰度，吸除培养液，加入适量 37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育 15 分钟～
45 分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
注：
也可以将细胞置于培养皿中的盖玻片上，加入合适培养基，使其爬片生长。
3) 利用新鲜培养基替换上述染色液。
注：
若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
4) 荧光显微镜（含合适滤片）或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最大激发/发射波长为 579 / 599nm。或者
进行后续的固定和透化步骤。
2.2 对于悬浮细胞
1) 离心，吸除上清。
2) 利用 37℃预热的探针工作液重悬细胞，于生长状态下孵育 30 分钟～2 小时（具体时间需根据细胞类型而
定，需预实验优化）。
3) 离心，吸除染色液，加入新鲜培养液重悬细胞。
4) 置于荧光镜下观察。或流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最大激发/发射波长为 579/ 599nm。或者进行后续
的固定和透化步骤。
注：
对于悬浮细胞，也可将细胞贴附于经细胞粘合剂处理过的盖玻片上，然后使用类似于贴壁细胞的方法进行
染色。
如果需要盖玻片上固定化的细胞，那么可在铺片前可以先用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）包被载玻片或
盖玻片。
若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
3.固定和透化：
1) 染色结束后，利用培养液或缓冲液清洗细胞；
2) 小心吸走清洗液。换用新鲜配制且预热的含 2-4%甲醛的缓冲液或培养液进行细胞固定。
3) 清洗细胞：吸除固定液，用适当缓冲液冲洗细胞数次。
4) 细胞透化（可选）：
ICC 等实验需要细胞要做透化，可将已固定的细胞直接加入含有去污剂如 Triton X-100 的缓冲液中孵育。
透化结束后，用缓冲液清洗细胞即可进行后续 ICC 实验。一般用含 0.2% Triton X-100 的 PBS 孵育细胞
10 分钟可以达到良好的透化效果。还可利用预冷的丙酮透化 5 分钟，之后用 PBS 清洗细胞。经验证，即
使后继没有进一步的抗体标记，丙酮透化处理也可降低背景信号。
Yes
